外泌体在纯化过程中容易残留非囊泡结构的污染物,例如:组蛋白,DNA,脂蛋白颗粒等。因此,对纯化的外泌体进行多方面的表征鉴定对于其用于下游实验和向临床转化至关重要。国际细胞外囊泡学会(ISEV)建议对于分离获得的外泌体需要从大小,形态,表面标志物这三个方面进行。除此之外,还可以通过高通量测序,蛋白质谱,代谢组分析等组学方法对外泌体的内含物进行全面分析。
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大小
▪ 动态光散射(DLS);
▪ 纳米颗粒跟踪分析(NTA);
▪ 纳米流式(NanoFCM)
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形态
▪ 扫描电子显微镜(SEM);
▪ 透射电子显微镜(TEM);
▪ 冷冻透射电子显微镜(CryoTEM)
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表面标志物
▪ 蛋白质免疫印迹(WB);
▪ 酶联免疫吸附测定(ELISA);
▪ 纳米流式(nanoFCM)
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内含物
▪ 高通量测序(RNA, DNA);
▪ 蛋白质谱分析(Proteomics);
▪ 脂质组学分析(Lipidomics)
基于丰富的外泌体检测和鉴定经验,思珞赛推荐在进行外泌体定量分析的同时,对纯化的外泌体进行纯度(颗粒数/蛋白量)和囊泡比例的分析。
实验案例
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siRNA高效装载至EV膜表面
siRNA高效装载至EV膜表面。图为:1a. 纳米流式对比装载组与对照组原始数据。1b*. Cy5修饰的siRNA装载效率达到90% (Cy5+ EV/total EV), 或超过2500 RNA copies/EV(荧光强度标曲定量)。 1c. 外泌体携带Cy5-siRNA进入核表达GFP的细胞中,并分布于细胞质中。
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siRNA高效装载至EV腔内
siRNA高效装载至EV腔内。图为:2a. 纳米流式对比三组平行外泌体样品的siRNA装载原始数据。2b. FAM修饰的siRNA装载效率达到40% (FAM+ EV/total EV)。
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外泌体载有抗肿瘤药物多柔比星与等剂量游离药物(free drug)对于细胞活性的影响
外泌体载有抗肿瘤药物多柔比星与等剂量游离药物(free drug)对于细胞活性的影响。图为293T细胞对药物响应的细胞存活率实验。等剂量下(@1000nM, free Dox vs. Dox@EV, 其中D0为孵育装载,D2为电转装载,Dox@EV由SEC纯化后,Dox剂量由荧光强度测得),外泌体携带药物对细胞杀伤显著高于游离药物的药效。