外泌体在纯化过程中容易残留非囊泡结构的污染物,例如:组蛋白,DNA,脂蛋白颗粒等。因此,对纯化的外泌体进行多方面的表征鉴定对于其用于下游实验和向临床转化至关重要。国际细胞外囊泡学会(ISEV)建议对于分离获得的外泌体需要从大小,形态,表面标志物这三个方面进行。除此之外,还可以通过高通量测序,蛋白质谱,代谢组分析等组学方法对外泌体的内含物进行全面分析。
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大小
▪ 动态光散射(DLS);
▪ 纳米颗粒跟踪分析(NTA);
▪ 纳米流式(NanoFCM)
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形态
▪ 扫描电子显微镜(SEM);
▪ 透射电子显微镜(TEM);
▪ 冷冻透射电子显微镜(CryoTEM)
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表面标志物
▪ 蛋白质免疫印迹(WB);
▪ 酶联免疫吸附测定(ELISA);
▪ 纳米流式(nanoFCM)
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内含物
▪ 高通量测序(RNA, DNA);
▪ 蛋白质谱分析(Proteomics);
▪ 脂质组学分析(Lipidomics)
基于丰富的外泌体检测和鉴定经验,思珞赛推荐在进行外泌体定量分析的同时,对纯化的外泌体进行纯度(颗粒数/蛋白量)和囊泡比例的分析。
实验案例
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透射电子显微镜(TEM)获得外泌体形貌照片
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WB vs. nFCM
野生型细胞分泌外泌体,用流式抗体anit-CD9-APC和anti-CD81-APC标记经典外泌体跨膜蛋白CD9/CD81,亚群APC阳性比率相比未标记control,分别为47.4%和51.8% 通过基因编辑装载货物蛋白Payload-X的外泌体,用流式抗体anit-X-APC标记,亚群APC阳性比率相比未标记control,可达到99.2%。此结果表面货物蛋白的高效装载,装载效率接近100% 相比于传统的WB检测,nFCM样品用量更少且更方便定量不同亚群的比率。
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不同外泌体样品纯度的多维度比较
不同外泌体样品纯度的多维度比较: 对比EV-1(纯度较高)与EV-2(纯度较低) Triton裂解处理表征样品囊泡比率:通过比较外泌体样品Triton处理前后的颗粒数变化计算样品中囊泡的比率,以表征样品纯度。囊泡比率 = [1 - N (Triton处理后)/N (Triton处理前)] *100%
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不同技术(NTA vs. nFCM )测定外泌体颗粒浓度的对比
对比不同检测技术(NTA vs. nFCM )对外泌体颗粒浓度测定的区别:NTA(Nanosight 300)与nFCM(Apogee和厦门福流N30E)对于同一外泌体样品,在同样的稀释策略下,测得的颗粒数浓度(particles/mL)如图。可以看到,不同检测技术对颗粒浓度的测算结果不同。因此,比如使用“颗粒数/蛋白”这一参数对外泌体样品纯度进行表征时,也应明确颗粒数检测所用的具体方法和仪器,同时也需要其他纯度测定方法辅助和互相印证。Apogee_nFCM对于外泌体颗粒数浓度的测值偏保守,低于另两种测试仪器。